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为了让资源优势转变为基因优势
发布: 陶大云、李静   发布时间:2018-06-12   浏览次数:4053    [] [] []

民以食为天。自有人类活动以来,先民们对农作物的驯化就从来没有停止过。从早期先民自发地对野生物种的驯化、到农民对驯化物种的培育使得农作物从原始野生的物种变成了栽培物种,这一过程大幅度提高了农作物的产量,但是,由此也带来了农作物栽培品种遗传的单一化、生物和非生物抗性的脆弱性、难于打破的产量平台等突出问题。究其原因,主要是人类在对农作物改良驯化过程中,少数几个优良的核心亲本被反复使用,短期内对农作物的产量、抗性、品质有了很大提高,但同时也加剧了栽培品种基因库的单一化。就水稻而言,栽培稻野生近缘种中保留了稻属赖以生存的几乎所有基因资源,然而,这些种质资源中95%以上的材料从未在育种中利用过。因此,野生近缘种中重要新基因/等位变异的发掘与利用是现代稻作农业生产发展的创新原动力。云南虽被称为资源王国,但并不是资源强国,更不是基因王国,反而每年要花大量人力、物力进行资源保存。

云南省农科院粮作所陆稻野生稻课题组在各方的支持下,以有利新基因发掘与育种利用、育种新方法、种间杂种不育的规律等为研究重点,几十年来的实践总结形成了栽培稻种间杂交育种方法,发掘了Rhz2Rhz3Dep4Ep4Pi57等有利新基因,发现了S29(t)12个种间杂种不育新基因,2003年课题组以第一作者身份在《PNAS》发表论文、2010年作为作者之一在《Science》发表论文、2017年作为作者之一在《Molecular Plant》发表论文、2018年作为作者之一在《Nature Communications》发表论文、2018年以共同通信作者在《Science》发表论文。

稻属AA基因组种间杂交育种新方法探索与实践

云南省农科院粮作所陆稻野生稻课题组陶大云研究团队自二十世纪八十年代就致力于稻属AA基因组野生近缘种有利基因发掘利用研究工作。稻属包括两个栽培种(亚洲栽培稻及非洲栽培稻)及22个野生种,其中两个栽培种及6AA染色体组野生种均属于二倍体稻种。目前世界上广泛种植的稻种均为亚洲栽培稻,而非洲栽培稻(Oryza glaberrima)是独立于亚洲栽培稻而于公元前1500年左右起源于西非尼日尔河流域的另一栽培稻种,目前仅在西非局部地区种植。作为栽培种,非洲栽培稻本身就是优良基因积累较多的遗传资源,特别是非洲栽培稻对黄斑驳病毒病、稻瘟病、线虫、绿叶蝉的抗性及对酸性土、铁毒、干旱的耐性和旺盛的营养生长趋势,都是值得开发利用的有利性状,并且与亚洲栽培稻杂交后F1减数分裂正常,因此非洲栽培稻被认为是改良亚洲栽培稻、创建种间强大杂种优势的首选物种。

同时期,西非稻作发展协会Monty Jones研究团队结合传统回交育种技术和现代生物技术,利用亚洲栽培稻与非洲栽培稻杂交,获得了较非洲栽培稻生育期更短、更高产的新型水稻品种“非洲新稻”(New Rice for Africa, NERICA),为解决非洲粮食问题开辟了一条新的道路。Monty Jones因此被誉为非洲新稻之父,并于2004年与袁隆平一同获得了世界粮食奖。

陶大云研究员从西非稻作发展协会、国际水稻研究所引进了一些非洲栽培稻及非洲新稻,并用13个亚洲栽培稻品种(9个籼稻,4个粳稻)和13个非洲栽培稻品种配制了籼粳交、籼非交、粳非交等种间/亚种间杂交组合。通过调查F1各农艺性状,得到如下结论:1、两栽培稻细胞质对种间可交配性的影响是显著的,利用非洲栽培稻作母本进行杂交可更易获得杂交种;2、籼非杂交种在分蘖期的单株干重及单株茎蘖数显著高于籼粳杂交种,粳非杂交种与籼粳杂交种均具有显著超亲的生物产量。相关研究结果发表在《西南农业大学学报》上。

同时也发现,栽培稻种间杂交虽可获得少量F1杂交种,但F1植株几乎无可育花粉,仅有少数胚囊可育,但连续回交后自交可在一定程度解决不育问题,与前人研究结果一致,因此种间杂种不育是非洲栽培稻有利基因利用及杂种优势利用最大的障碍。日本Sano研究团队对种间杂种不育基因S1的遗传及定位进行了研究(Sano 1979)。基于此研究结果,研究团队提出利用带有非洲栽培稻等位基因的亚洲栽培稻作为桥梁亲本,应是克服栽培稻种间杂种不育策略之一。

西非稻作发展协会通过两个手段克服栽培稻种间杂种不育。一方面根据F1少数胚囊可育这一现象,用杂交种作母本,用轮回亲本作父本进行持续回交;另一方面采用花药培养的方法,短期获得二倍体纯合植株。研究团队用非洲栽培稻作为母本,亚洲栽培稻作为父本,其中部分亚洲栽培稻带有非洲栽培稻S1等位基因,采用持续回交的办法获得了一批苗期长势旺盛、秆硬抗倒、丰产性突出、抗稻瘟病、抗白叶枯病、耐酸、香味等特点的育种中间材料。从这些材料中,研究团队筛选到一个茎杆粗硬、穗大、粒较大、熟色好、抗稻瘟病的株系。此株系以非洲栽培稻IRGC102203为母本,Boro5为父本杂交获得F1,以F1作母本、滇系1号为父本杂交,之后三交种作母本、轰杂135作父本杂交获得IRGC102203/Boro5//滇系1///轰杂135,自交加代至F9。并于2002年夏在楚雄进行品比试验,其产量较对照合系39号增产3.76-18.56%,定名为云稻1号,参加了2003-2004年省中部粳稻区域试验,2005年通过云南省审定。这是世界上第一个亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂交育成的粳型水稻新品种。

19964-19974月,陶大云在泰国农业大学进行为期一年的访问进修。学习远缘杂交方法,并利用胚挽救技术获得了亚洲栽培稻与长雄野生稻种间杂交F1植株。长雄野生稻(O. longistaminata)与亚洲栽培稻同属于AA基因组,是广泛生长于热带非洲的一个野生种,具有长柱头、大花药、自交不亲和、异花授粉和地下茎等特性的多年生植物,它具有很多抗生物胁迫和非生物胁迫的优异特性。

利用此F1植株,研究团队开展了长雄野生稻地下茎(胡凤益,2002Hu, et al. 2003),大柱头、大花药(周家武,2003),化感抗稗草(张付斗等,2004),抗螟虫等遗传特性的研究。相关研究论文发表于《PNAS》、《西南农业学报》等杂志。

与亚洲栽培稻同属于AA基因组的野生近缘种除上述提到的非洲栽培稻、长雄野生稻外,还有5个野生稻,分别为巴蒂野生稻(Oryza barthii,普通野生稻(Oryza rufipogon,尼瓦拉野生稻(Oryza nivara,展颖野生稻(Oryza glumaepatula),南方野生稻(Oryza meridionalis)。这些野生稻含有很多优良性状,例如抗病性、抗虫性以及其它抗胁迫性,因此是栽培稻改良可利用的巨大基因库。

通过上述研究尝试,研究团队于2004年利用种间杂交方法开始进行系统化种间杂交工作。研究团队从国内外引进、收集的AA基因组野生种中选择尼瓦拉野生稻21份、普通野生稻24份、展颖野生稻9份、南方野生稻9份、短舌野生稻18份、长雄野生稻9份及非洲栽培稻103份、亚洲栽培稻的陆稻181份为供体,用粳稻品种云稻1号和滇粳优1号为母本与普通野生稻、印度野生稻、展颖野生稻、南方野生稻、短舌野生稻、长雄野生稻、陆稻杂交、回交,非洲栽培稻用携带亚洲栽培稻与非洲栽培稻的种间杂种不育基因S1的桥梁亲本滇粳优1S1为轮回亲本杂交、回交至BC3F1,所有组合在回交过程中观察花粉育性及结实率,结实率大于30%的家系选择进行自交,育性低于30%的家系继续回交,形成BC2-BC6的渗入系26459

在正常栽培条件下筛选有效穗、穗粒数、粒型、粒重、直立穗等变异,在无干旱压力的陆生环境下筛选陆生适应性变异,在大棚营养生长、生殖生长期干旱条件下筛选抗旱性,共获得来自亚洲栽培稻陆稻、AA基因组野生近缘种具有稳定穗型、粒型、株型、壳色、米色、抗旱、陆生适应性、稻瘟病抗性等表型稳定近等基因系6623份。包括以普通野生稻、印度野生稻、展颖野生稻、南方野生稻、短舌野生稻、亚洲栽培稻陆稻为供体,云稻1号为受体的重要农艺性状近等基因系3273份;滇粳优1号为受体的重要农艺性状近等基因系2834份;以非洲栽培稻为供体滇粳优1号为受体的近等基因系251份;以籼稻RD23为受体长雄野生稻为供体的渗入系265份,并对以上近等基因系进行单穗加代繁殖,自交世代均在F7代以上。这些表型稳定的渗入系,是系统发掘稻属AA基因组重要农艺性状基因及稻作育种创新的有利种质资源。

对其中3249份目标性状与轮回亲本差异显著的渗入系进行了两种季节(环境)的重复评价。根据国际热带农业研究中心、康奈尔大学、法国国际农业合作研究中心(Orjuela et al., 2010)设计的、适用于亚洲栽培稻及稻属野生近缘种间多态性丰富的通用SSR引物进行基因型评价,在均匀分布的165Anchor(标记镞)上(代表517个标记),从每个Anchor上选取12个标记,全基因组共选取分布均匀的168个标记进行渗入系的基因型评价,针对不同供体间多态性存在差异的情况,基因型数据按扩增的分子量大小读取。

结合渗入系表型、基因型,根据二项式分布的概率对相应表型的QTL进行定位。具体方法为:在具有目标性状的所有渗入系中,如果某标记出现的实际概率显著高于理论概率,且显著性达到P<0.0001,即认为该标记可能与目标性状QTL连锁,该标记被称为目标标记,之后用渗入系自交或与轮回亲本回交形成分离群体,调查分离群体单株表型及目标标记的基因型,进行QTL定位。

利用二项式分布共检测到植株形态性状(包括株高、株型、穗型)、籽粒形态性状(包括芒、稃毛、稃色、粒型、果皮色等)、产量性状(包括、穗数、穗粒数、粒重等)的候选QTL326个,这些中间材料及QTL为系统化、规模化发掘有利基因以及水稻育种、种质创新提供了原动力。

基于上述研究检测到的新的、育种利用价值高的有效穗、穗粒数、粒型、粒重、直立穗、陆生适应性、抗旱性、杂种不育主效新基因(QTL),用相应渗入系与相应轮回亲本杂交、回交/自交,构建次级遗传群体对目标性状进行分子定位。用渗入系中目标SSR标记对次级群体进行基因分型,结合次级群体个体的表型,应用相关分析法、单标记分析法、区间作图法等对目标QTL进行定位。利用此方法定位到了长雄野生稻的1个株高基因(Chen et al. 2009);来自长雄野生稻的1个稻瘟病新基因Pi57(t)Xu et al. 2015);来自展颖野生稻的1个直立穗新基因EP4(Zhang et al. 2014);从长雄野生稻、展颖野生稻、尼瓦拉野生稻及非洲栽培稻四个种中,同时定位到了控制粒长的GS3基因(Zhang et al. 2015),从陆稻中到位了3个陆生适应性QTLqAER1 qAER3 qAER7;以及15个种间杂种不育基因。相关内容发表于《Euphytica》、《Breeding Science》、《Mol Breeding》、《Plos One》、《Heredity》等期刊上。

研究团队在对稻属AA基因组野生近缘种有利基因进行挖掘、定位的基础上,积极开展有利基因育种利用研究。以南亚东南亚、非洲广泛推广应用的主要水稻品种为基础、起点,利用分子标记辅助选择、回交等技术手段,将已明确育种价值的陆生适应性基因(QTL)、直立密穗基因导入,培育适应南亚、东南亚、非洲的高产、优质水陆稻新品种。目标是实现联合创制在品种比较试验增产5%以上的优异新种质50 份以上。目前,已向2个来自尼泊尔、4个来自缅甸的水稻品种中导入了陆生适应性QTL2个来自埃及和1个来自孟加拉的主栽品种中导入了直立密穗基因,此外,对在南亚东南亚、非洲广泛推广的品种IR64转入直立穗、陆生适应性基因也在进行中。

稻属AA基因组种间杂种不育研究

由于缺乏克服种间杂种不育的对策,稻属AA基因组有利基因仍大量流失。杂种不育是植物受精后生殖隔离最普遍的形式,杂种不育一方面阻碍了物种间的基因交流,另一方面保持了物种遗传的稳定性,在物种起源与分化研究中具有重要意义。因此认识杂种不育是打破种间生殖隔离、利用野生近缘种中丰富遗传变异、杂种优势、研究物种起源与分化的基础。二十世纪八十年代,亚洲栽培稻籼粳亚种间的杂种不育已有大量研究,而稻属种间杂种不育鲜有报道,但相关研究认为稻属种间与亚种间杂种不育均为核基因控制,并可以用两种模型来解释:单位点孢子体-配子体互作模型(one-locus allelic interaction mode)(Kitamura 1962)及重复隐性配子致死模型(duplicate recessive gametophytic lethal mode)(Oka 19581974)。单位点孢子体-配子体互作模型认为是等位基因互作导致杂种不育,而重复隐性配子致死模型则强调非等位基因间的互作导致杂种不育。

栽培稻种间杂种不育基因的研究最早来自于日本Sano团队对亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育基因S1的报道(Sano 1979)。研究团队设想利用带有非洲栽培稻等位基因作为桥梁亲本,克服栽培稻种间杂种不育这一障碍。然而,当携带非洲栽培稻等位基因S1-glaberrima的亚洲栽培稻滇粳优1号与非洲栽培稻杂交后,虽然F1花粉育性与小穗育性有了显著提高(花粉育性由1.88%提高至3.58%,小穗育性由6.31%提高至9.33%)(Deng et al. 2010),但仍无法解决育性障碍这一难题,同时通过测交的方法检测到栽培稻种间杂种不育除S1外还有其它不育基因控制。

面对种间杂种不育这个在远缘杂交育种中绕不过去也克服不了的难题,研究团队决定深入研究这一问题。二十世纪九十年代末期,第二代分子标记SSR在水稻遗传研究中的应用使得数量性状基因定位方兴未艾。研究团队配制了亚洲栽培稻(WAB450-16)与非洲栽培稻(CG14)的杂交组合,然后用F1作母本,亚洲栽培稻做父本进行回交获得BC1F1群体,并调查了BC1F1个体花粉育性。BC1F1群体花粉育性、小穗育性呈连续分布,表明种间杂种不育受QTL控制,因此计划利用SSR分子标记构建遗传连锁群,进行花粉育性QTL分析,并根据QTL分析结果,选择携带QTL且背景更单一的单株进行回交。但由于受当时实验条件所限,每天所能获得的最大数据量仅为200个左右,也就是说对于样本量为200的群体,构建一个包含200个标记的连锁群至少需要200天的时间。面对这一条件短板,研究团队采用了仅选择表型,连续回交的策略。即BC1BC6世代,并不进行基因型选择,每一世代仅调查花粉育性,选择不育株(花粉育性90%)作母本,连续回交至BC6BC6世代绝大多数单株花粉育性已呈半不育,符合单位点孢子体-配子体互作模型,即通过反复的选择、回交,QTL已分解成了单个的孟德尔遗传因子。用143对覆盖全基因组的SSR引物对BC6世代44株半不育单株进行基因分型。根据二项式分布的概率对花粉育性位点进行定位。由于所有单株花粉育性均为半不育,如果某标记在44株半不育株中的实际杂合率远高于理论杂合率,且显著性达到P<0.0001,即认为该标记可能与花粉不育基因连锁。根据这一分析结果,选择带有目标染色体片段的单株自交或与轮回亲本回交,形成次级定位群体对不育位点进行定位。

利用此方法,研究团队定位了栽培稻种间杂种不育基因S1S19S20S29S37S38S39Hu et al. 2006, Li et al. 2008, Li et al. 2010, Xu et al. 2014),其中S1S19S20与已发表栽培稻种间杂种不育基因一致,在验证了其他研究同行结果的同时也有了新的发现。相关研究结果发表于《Euphytica》、《Breeding Science》期刊上。

2004年,在用亚洲栽培稻与稻属AA基因组8个种规模化、系统化地进行种间杂交的研究中,杂种不育作为其中最重要的性状进行了系统地研究。利用反复选择、回交培育近等基因系的策略,定位了亚洲栽培稻与长雄野生稻种间杂种不育基因3个(Zhao et al. 2012, Chen et al. 2009, Chen et al. 2017);亚洲栽培稻与南方野生稻杂种不育基因5(Li et al. in press);亚洲栽培稻与展颖野生稻杂种不育基因2(Zhang et al. 2018);亚洲栽培稻与尼瓦拉野生稻、普通野生稻、巴蒂野生稻种间杂种不育基因各1个(Yang et al. 2016)。相关研究结果发表于Euphytica》、《Breeding Science》、《Heredity和《Rice Science》上,占国内外已发表稻属种间杂种不育基因半数以上。

通过标记对比发现,已定位的一些杂种不育基因间存在很好的共线性关系。S1是亚洲栽培稻(Oryza sativa)与非洲栽培稻(O. glaberrima)间最重要的杂种不育基因,普遍存在于亚洲栽培稻与非洲栽培稻的杂交组合中Koide et al. 2008, Sano 1990, Zhou et al. 2010。同时在亚洲栽培稻与普通野生稻(O. rifupogon)、长雄野生稻(O. longistaminata)、巴蒂野生稻(O. barthii)及尼瓦拉野生稻(O. nivara)的杂交组合中也在相同染色体区域检测到了主效杂种不育基因,其配子消除方式、花粉败育类型均与S1类似(Chen et al. 2009Yang et al. 2016)。另外,在亚洲栽培稻籼粳亚种间的不育基因S10同样位于第六染色体短臂S1相同区域(Sano et al. 1994, Heuer et al. 2003)。这些来自不同种(亚种),位于相同染色体区域,且功能相似的杂种不育基因很可能是相互等位的直系同源基因(Hu et al. 2006)

这样的事例还有很多,非洲栽培稻(S29)、巴蒂野生稻(S29)、展颖野生稻(O. glumaepatula, S22)、南方野生稻(O. meridionalis, S53(t))均在第二染色体短臂相同区域定位了花粉灭杀基因(Hu et al. 2006, Sobrizal et al. 2000, Tao et al. 2009)。非洲栽培稻(S21)、展颖野生稻(S23)、南方野生稻(S55(t))、普通野生稻、尼瓦拉野生稻在第七染色体长臂相同区域定位了花粉灭杀基因(Doi et al. 1999, Sobrizal et al. 2000, Miyazaki et al. 2007b, Tao et al. 2009)。亚洲栽培稻与非洲栽培稻杂交组合的种间杂种不育基因S39(t)位于水稻第12染色体短臂上(Xu et al. 2014),很可能与尼瓦拉野生稻携带的S36及籼稻的S25等位(Win et al. 2009)。这些在稻属AA基因组中高频出现的杂种不育基因很可能是相互等位的垂直同源基因,但彼此间杂交不育,暗示这些不育基因存在等位变异。

为证实种间杂种不育基因是否存在等位变异,研究团队利用已培育的同一遗传背景(滇粳优1号),且分别携带非洲栽培稻等位基因S1S19S20S37S38S39的亚洲栽培稻近等基因系作为测验种,分别与11AA基因组亚洲栽培稻及野生近缘种测交,通过对F1花粉育性进行等位变异度分析(方法参照:张桂权等,1993)。结果表明,在S1S37S38S39基因座上不仅包括亚洲栽培稻、非洲栽培稻两个等位基因,还存在中性等位基因(种间广亲和基因),进一步地通过分子标记证实了S38S39基因座上的中性等位基因的存在(Li et al. in press)。考虑到此等位变异仅是基于亚洲栽培稻与非洲栽培稻间的杂种不育基因座,若拓展到栽培稻与野生稻间,以及野生稻间的杂种不育基因座,等位变异应更为丰富。因此,下一步的研究重点将是对来自不同种/亚种具有垂直同源关系的不育基因进行克隆的基础上,横向比对不同单倍型间的互作与种间杂种不育的关系。

不育基因研究的最终目的就是为了打破生殖隔离,因此研究团队将携带不同育性基因的近等基因系两两杂交,利用标记辅助选择方法将不育基因聚合,再用带有聚合育性基因的亚洲栽培稻作为桥梁亲本与非洲栽培稻杂交。研究表明,携带3个非洲栽培稻育性等位基因的亚洲栽培稻具有显著的桥梁作用,与非洲栽培稻杂交后,F1花粉育性较对照有了显著提高(未发表数据)

为更好地理解种间杂种不育,研究团队开展了种间杂种不育基因的克隆工作。S1是亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间最重要、最普遍的种间杂种不育基因,作为配子消除子同时作用于雌雄配子,携带非洲栽培稻S1等位基因的近等基因系与轮回亲本杂交后,F1植株携带亚洲栽培稻的配子败育,因此花粉及小穗均表现为半不育。2009年研究团队与华南农业大学刘耀光团队合作对栽培稻种间杂种不育基因S1进行克隆研究。由于亚洲栽培稻与非洲栽培稻在S1定位区域的染色体结构差异较大,非洲栽培稻与亚洲栽培稻相比有大片段的插入及缺失,因此S1亚洲栽培稻定位区域为27.8kb,而非洲栽培稻为50.3kbS1基因的克隆工作一度陷入困境。直至2017年运用CRISPR/Cas9基因敲除技术才确定了S1基因座的关键基因OgTPR1非洲栽培稻OgTPR1基因敲除后植株雌雄配子的育性不受影响,但能恢复杂种F1雌雄配子的育性。OgTPR1与亚洲栽培稻等位基因OsTP1间仅有一个SNPC-A)的差异,这个核苷酸的差异导致了亚洲栽培稻编码提前终止(Xie et al. 2017)。

同时与南京农业大学万建民院士团队合作开展了栽培稻种间杂种不育基因S19S37S38S39的克隆研究。进化研究普遍认为亚洲栽培稻起源于亚洲,祖先种为普通野生稻、尼瓦拉野生稻,而非洲栽培稻起源于非洲,祖先种为短舌野生稻,两个栽培种有着独立而平行的进化关系,染色体结构差异较大。同S1基因遇到的困难一样,亚洲栽培稻与非洲栽培稻在基因的定位区域均存在较大的染色体结构差异,与亚洲栽培稻相比,非洲栽培稻存在大片段的插入、缺失、易位、倒位,克隆工作进展并不顺利。

2011年,研究团队与南京农大万建民院士团队合作进行了S55(t)(即qHMS7)的克隆。S55(t)是一个作用于亚洲栽培稻(滇粳优1号)与南方野生稻的种间杂种不育基因,位于水稻第7染色体长臂,植株基因型为杂合时,携带南方野生稻等位基因的雄配子被灭杀,花粉育性表现为半不育(Li et al. in press)。克隆研究表明qHMS7包含三个紧密连锁的基因,ORF1ORF2ORF3,其中ORF1基因编码一个未知功能的蛋白;ORF2基因编码一个杀配子的毒性蛋白,以母体效应导致花粉死亡;而ORF3基因编码一个解毒蛋白,以配子体效应保护配子,使携带ORF3基因的花粉可育。由于南方野生稻缺乏解毒蛋白ORF3,因而杂合子中南方野生稻基因型的花粉被灭杀。qHMS7基因的遗传行为符合“自私基因系统”模型,指的是双亲杂交后,父本或母本中能控制其自身的DNA片段优先遗传给后代,使携带自私基因的亲本遗传信息能更多、更快地复制并更多地传递给子代,其遗传不符合孟德尔遗传规律。根据qHMS7三个基因ORF1ORF2ORF3在稻属AA基因组各个种中的序列比对,对qHMS7基因的演化进行了推导。在所有测序材料中,50.66%的普通野生稻及94.76%的亚洲栽培稻都有相同的ORF3单倍型,但其它AA基因组野生近缘种如南方野生稻、长雄野生稻、巴蒂野生稻、非洲栽培稻并无ORF3基因;而在所有测序材料中均含有ORF2基因,除南方野生稻及亚洲栽培稻两种单倍型(ORF2MORF2D)外还有25种单倍型(统称为ORF2N)。考虑到南方野生稻为原始种,且单倍型为ORF2N的材料有丰富的碱基序列差异,且无解毒基因ORF3,因此认为南方野生稻单倍型(ORF2M)先演化成ORF2N,在此基础上又演化出亚洲栽培稻单倍型(ORF2D,并推测ORF2NORF2M功能相似,是无功能的。在无ORF3ORF2D导致所有花粉不育,而用基因编辑技术敲除ORF2D后不育消除。此研究结果于201868日发表于世界顶级学术杂志《Science》上,云南省农业科学院粮食作物研究所作为共同完成单位。

实验平台建设

20世纪80年代后期至90年代,分子标记伴随着基因组的研究而产生。由于分子标记数量大、不受生物生长发育限制、检测手段简单、迅速等优点,可应用于遗传育种、基因组作图基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。而以SSR(微卫星标记)为代表的第二代分子标记因其共显性、易检测等特征在水稻分子育种中表现出了巨大的潜力。考虑到花药培养、胚培养等生物学手段在远缘杂交中的不可替代性,研究团队于1999年利用课题研究经费成立了分子标记及植物组培实验室。云南省农业科学院对此给予了大力支持,于1999830日正式挂牌成立“云南省农业科学院作物育种重点实验室”。国际水稻研究所McNally博士对实验室的成立及运行提供了大量的指导,先后7次访问云南省农业科学院,并先后对200余人次进行了分子实验指导与培训,同时引进了美国康奈尔大学、国际稻作所先进的实验技术、资料及数据分析软件共计1000余份。

同时,研究团队通过不懈地努力,对实验体系进行不断完善,探索出了符合研究需求,快捷、高效、稳定的实验体系。已具备开展稻作基因发掘、评价、精细定位、克隆、功能分析、分子育种的实验设备与技术平台。由于技术体系稳定、可靠,除完成课题组本身的研究任务外,还接受了其它作物(如花卉、马铃薯、麦类、玉米等)的相关研究任务,吸引并接纳了来自南京农业大学、中科院版纳植物园、中科院昆明植物所、云南大学、云南农业大学、云南省烟草研究院等科研院校的研究生到实验室进行实验研究。同时与国际水稻研究所、法国国际热带农艺研究中心等国外研究机构合作,多次开展以“分子生物学在作物育种中的运用”为主题的一系列培训班,吸引了广大科技人员参与,培养了一批科研实验人才。经过多年的实践与探索,已初步搭建了对外开放、合作共享的研究平台,初步实现了聚集和培养优秀科技人才、开展高水平学术交流的目的。

目前,实验室还建成了西南地区首个以基因芯片为核心技术的分子育种平台。该分子育种平台以全基因组基因扫描系统为核心,可对农作物进行全基因组基因分型,从而可进行全基因组选择、单核苷酸位点突变、拷贝数变异等相关研究,主要应用于农作物有利基因发掘定位、分子标记辅助选择、设计育种、遗传资源保护与利用等领域。基于基因芯片的分子育种平台可同时进行多至百万个位点的研究,缩短了作物育种的研究进程;同时基因芯片自动化程度高,对数据进行标准化处理,从而能够获得准确、稳定、可靠的研究数据。

对外合作

中国有句古话“能用众力,则无敌于天下矣;能用众智,则无畏于圣人矣”。研究团队非常注重对外的合作与交流,与非洲稻作发展协会、国际水稻研究所、法国国际热带农艺研究中心、华南农业大学、南京农业大学、中国科学院遗传与发育研究所建立了长期的合作关系。通过合作研究,进而合作申报项目的形式,取长补短,使研究团队始终保持鲜活的科研创新能力。

上述提到的种间杂种不育基因S1qHMS7的克隆工作均是对外合作的成果。此外与中科院遗传与发育研究所合作完成了直立穗基因DEP4的克隆,与云南省农科院资环所合作完成了抗稻瘟病基因Pi57(t)的克隆,与中科院版纳所合作进行陆生适应性基因的克隆。其中研究团队与中国科学院遗传与发育生物学研究所傅向东团队合作,利用筛选出的细长粒型的渗入系用于粒型基因的发掘研究,经过8年来多方合作努力,克隆并功能分析了控制粒长的LGY3基因,进一步的功能研究揭示,粒型基因GS3LGY3与直立密穗基因DEP1通过植物G蛋白信号途径的调控途径控制目标性状,剖析了植物细胞G蛋白信号转导途径调控种子大小作用的分子机制。通过聚合这3个基因的特定单倍型,可增加水稻穗粒数,提高水稻籽粒的长度、改善水稻籽粒的长宽比,达到同时改良水稻产量性状与品质性状的目的,在显著提升稻米品质的基础上还可使其产量增加7%以上。这项研究为水稻高产优质分子设计育种提供了具有重要应用价值的新基因以及通过基因聚合改良水稻品质的理论基础。此研究结果于2018227日在线发表于《Nature communications》。

另外,通过科技部发展中国家杰出青年科学家项目,每年向亚非国家招聘青年科学家2人,到云南农科院进行为期1-2年的合作研究,将已明确育种价值的陆生适应性基因(QTL)、直立密穗基因导入南亚、东南亚、非洲的优质水稻品种中,培育适应南亚、东南亚的高产、优质水陆稻新品种。

人才培养

一只木桶能盛多少水,并不取决于最长的那块木板,而是取决于最短的那块木板。任何一个团队,可能面临的一个共同问题,即构成团队的各个成员往往是优劣不齐的,而劣势部分往往决定整个团队的水平。因此,研究团队非常重视团队成员的培养与成长,团队多数人员都是到岗后获得硕士、博士学位、到国外接受培训。团队支持每位成员在职攻读学位,创造机会送团队成员出国参加培训,鼓励成员根据各自研究内容申报项目。团队现有成员6人,其中2人具有博士学位,4人具有硕士学位。2人为云南省学术技术带头人,1人为云南省学术技术带头人后备人才。陶大云研究员2007年入选新世纪百千万人才工程国家级人选,2011年获国务院特殊津贴。研究团队现拥有硕士研究生导师1人,设博士后流动工作站1个;研究团队共发表学术论文70篇(附表1),其中30篇被SCI收录,包括《Science2篇、《PNAS1篇。

小结

回顾这些年的研究,取得的这些成绩与各方面的长期支持、关怀密不可分,但以下经验也弥足珍贵:

1. 从重大、普遍生产问题提炼重大农学问题、重大科学问题,长期坚持、系统研究;

2. 应用研究与应用基础研究相结合,相互促进,既重视在重大、普遍生产问题的基础上开展应用基础研究,也注重在应用基础研究新进展的基础上高起点开展应用研究;

3. 好的团队、好的课题与材料、好的研究手段与条件、研究人员的努力、广泛合作对取得大的成功都很重要;

4. 人员的培养提升过程也就是研究的深入、拓展、合作交流过程、课题组的发展过程;

5. 国际视野与对重大生产问题、农学问题、科学问题的敏感、关注对科学研究的成功也很重要。

6. 研究团队通过多年的研究,探索出了规模化、系统化发掘有利基因的新方法;并已准备了大量有育种利用价值的中间材料;初步搭建了新基因发掘、分子育种的研究平台。我们将长期坚持“亚洲栽培稻及其野生近缘种有利新基因发掘与育种利用”这一方向,建立有利新基因发掘与分子育种平台、团队,服务云南、南亚东南亚、非洲,目的性状主要是产量、品质、陆生适应性、抗稻瘟病,坚持从基因到商品的区域伙伴关系,目标是变云南的资源优势为基因优势、产业优势,从资源王国向资源强国、基因王国转变。欢迎有意者加入,也期望在条件平台建设、人员团队建设等方面得到进一步支持。我们也不会辜负大家的期望,会在近期取得大的进展。

致谢

云南省农业科学院粮食作物研究所

云南省农业科学院

云南省科技厅

云南省外国专家局

国家自然科学基金委员会

农业农村部

科技部

国家外国专家局

洛克菲勒基金会、家乐福国际基金会

南京农业大学、华南农业大学、中国科学院遗传与发育生物研究所、中国科学院西双版植物园

课题组成员,关心支持课题组成长的领导、专家、管理服务人员

国际水稻研究所、法国国际农艺研究合作发展中心、西非稻作发展协会(现为非洲稻作中心Africa Rice Center, 简称AfricaRice

附件一:研究团队1993-2018年发表文章

序号

题目

期刊

发表年份

1

陆稻的国外引种

陕西师大学报

1993

2

粳型矮杆陆稻株高遗传研究

西南农业大学学报

1995

3

水陆稻在三亚及思茅的生育期及株高变化研究

西南农业大学学报

1995

4

籼型矮秆陆稻株高遗传研究

西南农业大学学报

1995

5

陆稻国外引种规律初探

西南农业学报

1996

6

一条新发现的水稻酯酶酶带及其应用

西南农业学报

1996

7

非洲栽培稻形态生理及与亚洲栽培稻种间育性研究

西南农业大学学报

1997

8

陆稻主要经济性状配合力研究

中国水稻科学

1997

9

陆稻新品种“IRAT104”的生理特性与栽培策略

1998

10

一条新发现的水稻酯酶同工酶酶带的遗传分析

西南农业学报

1998

11

核代换群体和系选品种在水稻耐冷性近等基因系研制中的作用

作物学报

2001

12

籼粳水陆稻杂交的株高和结实率遗传

西南农业学报

2002

13

野生稻和非洲栽培稻抗稗草作用研究初报

中国水稻科学

2002

14

栽培稻种间近等基因系杂种育性研究

中国水稻科学

2002

15

栽培稻种间杂种营养优势研究

西南农业大学学报

2002

16

Convergent evolution of perenniality in rice and sorghum

PNAS

2003

17

国外粳型陆稻品系育性恢复基因等位性分析

西南农业大学学报

2003

18

栽培稻种间近等基因系杂种育性遗传及其基因定位

中国水稻科学

2003

19

栽培稻种间杂种不育性初步研究

中国水稻科学

2003

20

Cytoplasm and cytoplasm-nucleus interactions affect agronomic traits in japonica rice

Euphytica

2004

21

Inheritance and mapping of male sterility restoration gene in upland

Euphytica

2004

22

关于加强云南稻作育种技术创新的思考

西南农业学报

2004

23

野生稻和非洲栽培稻抗稗草种质资源筛选和评价

作物学报

2004

24

野生稻化感抗耐稗草种质资源的初步研究

西南农业学报

2004

25

Breeding for perennial growth and fertility in an Oryza sativa/O.longistaminata population

Field Crops Research

2005

26

栽培稻种间杂交改良云南粳稻品种研究

中国水稻科学

2005

27

Developing rice cultivars for high-fertility upland systems in the Asian tropics

Field Crops Research

2006

28

Molecular mapping of a pollen killer gene S29(t) in Oryza glaberrima and co-linear analysis with S22 in O.glumaepatula

Euphytica

2006

29

氮肥在陆稻上的施用量研究初报

中国稻米

2006

30

A new Gamete Eliminator from Oryza glaberrima

RGN

2007

31

培育水稻主要产量性状杂优近等基因系探讨

西南农业学报

2007

32

Identification of four genes for stable hybrid sterility and an epistatic QTL from a cross between Oryza sativa and Oryza glaberrima

Euphytica

2008

33

Introgression and mapping of erect panicle gene from Oryza glaberrima into Oryza sativa

Rice Genetics Newsletter

2008

34

Weed-suppression ability of Oryza longistaminata and Oryza sativa

Allelopathy J

2008

35

Breeding rice for the sloping upland of Yunnan. In: Hossain M, Bennett J, Mackill D, Hardy B (eds.), Progress in crop improvement research. Los Banos (Phillipines)

International Rice Research Institute

2009

36

QTL analysis for hybrid sterility and plant height in interspecific populations derived from a wild rice relative, Oryza longistaminata

Breeding Science

2009

37

技术采用对农户间收入分配的影响:来自滇西南山区的证据

中国软科学

2009

38

水陆稻不同生育期干旱适应性研究

西南大学学报(自然科学版)

2009

39

水陆稻杂种优势研究

西南大学学报(自然科学版)

2009

40

云南南部山区农户陆稻生产的投入产出分析

湖北农业科学

2009

41

栽培稻种中育性S1基因桥梁亲本培育及分子验证研究

西南大学学报(自然科学版)

2009

42

长雄野生稻红米基因的发掘定位研究

云南农业大学学报

2009

43

Assessing the Impact of Agricultural Technology Adoption on Farmers’ Well-being Using Propensity-Score Matching Analysis in Rural China

Asian Economic Journal

2010

44

Farmers Adoption of Improved Upland Rice Technologies for Sustainable Mountain Development in Southern Yunnan

Mountain Research and Development

2010

45

Fine mapping of a gene responsible for pollen semi-sterility in hybrids between Oryza sativa L. and O.glaberrima Steud

Mol Breeding

2010

46

Genetic dissection of a chromosomal region conferring hybrid sterility using multi-donors from Oryza glaberrima

Euphytica

2010

47

Spr5 (t), a spreading panicle gene from Oryza glaberrima

Rice Genetics Newsletter

2010

48

The role of S1-g allele from Oryza glaberrima in improving interspecific hybrid sterility between O.sativa and O.glaberrima

Breeding Science

2010

49

基于倾向得分匹配法分析农业技术采用对农户收入的影响——以滇西南农户改良陆稻技术采用为例

中国农业科学

2010

50

长雄野生稻黑壳基因的分子定位及遗传研究

西南师范大学学报

2010

51

长雄野生稻紫色柱头性状的回交转移和基因定位研究

云南大学学报

2010

52

Cytoplasm affects grain weight and filled-grain ratio in indica rice

BMC Genetics

2011

53

Identification of rhizome-specific genes by genome-wide differential expression Analysis in Oryza longistaminata

BMC Plant Biology

2011

54

Molecular mapping of sterility QTL qSS-3, qSS-6a and qSS-7 as single Mendelian factors via NIL strategy

Rice Science

2011

55

水氮互作下长雄野生稻化感作用与田间抑草效果

作物学报

2011

56

A new gene controlling hybrid sterility between Oryza sativa and Oryza longistaminata

Euphytica

2012

57

Sex at the origin: an Asian population of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae reproduces sexually

Molecular Ecology

2012

58

A novel gene responsible for erect panicle from Oryza glumaepatula

Euphytica

2014

59

Mapping three new interspecific hybrid sterile loci between Oryza sativa and O. glaberrima

Breeding Science

2014

60

Seed length controlled by same locus in four different AA genome species of Genus Oryza

Rice Science

2014

61

Identification and mapping of a novel blast resistance gene Pi57(t) in Oryza longistaminata

Euphytica

2015

62

Mapping QTLs for hybrid sterility in three AA genome wild species of Oryza

Breeding Science

2016

63

Fine mapping of Pi57(t) conferring broad spectrum resistance against Magnaporthe oryzae in introgression line IL-E1454 derived from Oryza longistaminata

Plos One

2017

64

Genetic analysis of a hybrid sterility gene that causes both pollen and embryo sac sterility in hybrids between Oryza sativa L. and Oryza longistaminata

Heredity

2017

65

Interspecific hybrid sterility in rice Is mediated by OgTPR1 at the S1 locus encoding a peptidase_like protein

Molecular Plant

2017

66

G-protein βγ subunits determine grain size through interaction with MADS-domain transcription factors in rice

Nature communications

2018

67

A self genetic element confers non-Mendelian inheritance in rice

Science

2018

68

Mapping of S56(t) responsible for interspecific hybrid sterility between Oryza sativa and Oryza glumaepatula

Breeding Science

2018

69

Neutral Alleles at hybrid sterility loci of Oryza glaberrima from AA genome relatives in Genus Oryza

Breeding Science

2018

70

Mapping five novel interspecific hybrid sterile loci between Oryza sativa and Oryza meridionalis

Breeding Science

2018

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